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線粒體復(fù)合體Ⅰ試劑盒說(shuō)明書微量法
更新時(shí)間:2021-11-12 點(diǎn)擊量:1187

                                          規(guī)格:100管/96樣

線粒體復(fù)合體Ⅰ試劑盒說(shuō)明書

微量法

正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義

復(fù)合體Ⅰ(EC 1.6.5. 3)又稱NADH-CoQ 還原酶或NADH脫氫酶,廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中,是線粒體內(nèi)膜中最大的蛋白復(fù)合物。該酶催化一對(duì)電子從NADH 傳遞給CoQ,同時(shí)可使O2還原生成O2.-,是呼吸電子傳遞鏈上產(chǎn)生O2.-的主要部位。測(cè)定該酶活性,不僅可以反映呼吸電子傳遞鏈(ETC)狀態(tài),而且可以反映活性氧(ROS)生成狀態(tài)。

測(cè)定原理

復(fù)合體Ⅰ能夠催化NADH脫氫生成 NAD+,在340nm下測(cè)定NADH的氧化速率計(jì)算出該酶活性的大小。

需自備的儀器和用品

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

試劑一:液體 100mL×1 瓶,-20℃保存;

試劑二:液體 20mL×1 瓶,-20℃保存;

試劑三:液體 1.5mL×1 瓶,-20℃保存;

試劑四:液體 25mL×1 瓶,-20℃保存;

試劑五:液體 1mL×1 支,-20℃保存;

試劑六:粉劑×1 支,-20℃保存,用時(shí)加入2mL蒸餾水,現(xiàn)配現(xiàn)用。

工作液的配制:臨用前將試劑五轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解;現(xiàn)配現(xiàn)用;

樣本的前處理:

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

① 準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞,加入1mL試劑一和10uL試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

② 將勻漿600g,4℃離心 5min。

③ 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心10min。

④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅰ(此步可選做)。

⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體,加入200uL試劑二和2uL試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復(fù)30次),用于復(fù)合體Ⅰ酶活性測(cè)定。

測(cè)定步驟:

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm,蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

1)工作液于37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)孵育5min。

2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、200μL工作液和15μL試劑六,混勻,記錄340nm處初始吸光值A12min 后的吸光值A2,計(jì)算ΔA=A1-A2。

復(fù)合體Ⅰ活力單位的計(jì)算

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下:

1)按蛋白濃度計(jì)算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅰ活力(nmol/min /mg prot=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T

=1808×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2) 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅰ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W×V樣÷V樣總)

÷T=365×ΔA÷W

3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅰ活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.73×ΔA

V 反總:反應(yīng)體系總體積,2.25×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L/mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,2 minW:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬(wàn)。

b.使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下:

1)按蛋白濃度計(jì)算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅰ活力(nmol/min/mg prot=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T

=3616×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2) 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅰ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)

÷T=730×ΔA÷W

3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅰ活力(nmol/min/104cell=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=1.46×ΔA

V 反總:反應(yīng)體系總體積,2.25×10-4 L;ε:NADH 摩爾消光系數(shù),6.22×103L/mol/cm;d96孔板光徑,0.5cmV 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.202 mL;

T:反應(yīng)時(shí)間,2 min;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬(wàn)。

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