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CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖毒性的方法
更新時(shí)間:2020-11-24 點(diǎn)擊量:2012
  CCK8試劑用于簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為:該試劑中含有WST-8【化學(xué)名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】,它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*(1-Methoxy PMS)的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物(Formazan dye)。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。
 
  CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖/毒性的方法:
 
  1.將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞胰酶消化后,*培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液,并計(jì)數(shù)。
 
  2.根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)快慢決定鋪板細(xì)胞密度(多數(shù)為1000-2000 cell/well),每組3-5重復(fù),每孔100-200μl培養(yǎng)基。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)決定鋪板數(shù)量(如需要檢測(cè)5天,則鋪5張96孔板),我們以1000 cell/well,5復(fù)孔,200μl培養(yǎng)基,檢測(cè)5天為例,各實(shí)驗(yàn)組需要細(xì)胞數(shù)量為1000×5×5個(gè)細(xì)胞,從計(jì)數(shù)好的細(xì)胞懸液中取出所需的細(xì)胞量和*培養(yǎng)基混勻,體積為200×5×5μl。
 
  3.統(tǒng)一鋪好后,待細(xì)胞*沉淀下來(lái)后,在顯微鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞密度,如果密度不均勻,則固定一組,微調(diào)其他組細(xì)胞的量再次鋪板(如:發(fā)現(xiàn)NC組細(xì)胞較多,降低細(xì)胞量再次鋪板),放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
 
  4.從鋪板后開(kāi)始,每孔加入10-20μl CCK-8溶液,如果每孔的培養(yǎng)基為100μl,則加入10μl CCK-8溶液,如果每孔的培養(yǎng)基為200μl,則加入20μl CCK-8溶液(注意不要在孔中生成氣泡,它們會(huì)影響OD 值的讀數(shù))。用加了相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒(méi)有加入細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照。
 
  5.在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1-4小時(shí),對(duì)于大多數(shù)情況孵育2小時(shí)左右就可以了。
 
  6.用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度(使用酶標(biāo)儀之前要提前開(kāi)啟10min預(yù)熱)測(cè)定完成后,保存數(shù)據(jù)。
 
  7.連續(xù)五天檢測(cè),每天保持一樣的時(shí)間點(diǎn)加入CCK-8溶液,在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育時(shí)間相同。
 
  注:若暫時(shí)不測(cè)定OD值,可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測(cè)定,吸光度不會(huì)發(fā)生變化。

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