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蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印法檢定蛋白質(zhì)
更新時間:2012-08-14 點擊量:2558

蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印法檢定蛋白質(zhì) 

    蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE后,膠片浸入轉(zhuǎn)印緩沖液,蛋白質(zhì)可被轉(zhuǎn)印到硝化纖維紙(nitrocellulose) 上,先經(jīng)?素洗去SDS,并使蛋白質(zhì)回?原態(tài)抗原性,可使用抗體進(jìn)?免疫染色 (Towbin et al, 1979)。

儀器用具:電泳轉(zhuǎn)印槽 (Hoefer Transphor TE 52):轉(zhuǎn)印槽 可容納個轉(zhuǎn)印三明治轉(zhuǎn)印三明治 轉(zhuǎn)印夾、方形海綿墊轉(zhuǎn)印紙:早期使用硝化纖維紙,現(xiàn)在多用尼龍材質(zhì)者Immobilon P (Millipore IPUH 000 10, 0.45 μm, PVDF 材質(zhì)濾紙 (Whatman #1, 3MM) 兩張,裁成比轉(zhuǎn)印紙稍大者。供電器 可供400~500 mA方形培養(yǎng)皿 轉(zhuǎn)印紙清洗用旋轉(zhuǎn)搖蕩器 (rotary shaker)

 

    藥品試劑:

    轉(zhuǎn)印緩沖液 (Blotting buffer)10×溶液

    Tris (Tris base, 25 mM×10) 60.6 gm

    甘胺酸 (0.192 M×10) 288 gm加水1,500 mL 溶的,pH HCl 調(diào)到8.3,加水至 2,000 mL 使用時取500 mL 倒入一5 L 桶中,加500 mL 甲醇后,加水到5 L,均勻攪拌的。 如此配成者,含10%甲醇;?是轉(zhuǎn)印勝或是蛋白質(zhì)的分?太小,可提高到20%。

    甲醇 (?潤濕尼龍材質(zhì)的轉(zhuǎn)印紙

    PBST 洗液:PBST pH 7.0 PBS (phosphate buffered saline) 緩沖液,另加有0.05%Tween-20,用?清洗轉(zhuǎn)印紙,以去除非專一性的蛋白質(zhì)吸附

    ?素洗液 (6M Urea-PBST) :?180 gm 溶在300 mL PBST 中,加溫攪拌溶解,再加PBST 500 mL。

 

    方法步驟:

    ◆ 全程請戴手套操作,以免污染轉(zhuǎn)印紙!

    1) 電泳后SDS-PAGE 膠片浸在轉(zhuǎn)印緩沖液中,洗2~3 次,每次10 min

    2) 取出轉(zhuǎn)印槽,先小心放一攪拌子在底部,再倒一半轉(zhuǎn)印緩沖液。

     攪拌子千萬?能丟到轉(zhuǎn)印槽內(nèi),會打破轉(zhuǎn)印槽底部的陶瓷散熱片。

    3) 取轉(zhuǎn)印紙切成約如膠片大小,先在方形培養(yǎng)皿中以少許甲醇浸濕數(shù)秒鐘,再置入轉(zhuǎn)印槽中的緩沖液10 min 后使用。 另取兩張濾紙,以及兩片方形海綿墊,?放在轉(zhuǎn)印槽的緩沖液中備用。

    4) 取出轉(zhuǎn)印夾打開平放,先墊一張方形海棉墊,鋪上一張濕濾紙,小心迭上已潤濕的轉(zhuǎn)印紙,其間勿陷入氣泡;轉(zhuǎn)印紙再滴上數(shù)滴緩沖液后,小心平鋪膠片上去,加蓋一層濾紙,及另一張海綿,也??可陷入氣泡,即可把整個轉(zhuǎn)印三明治卡夾裝好。

     膠片迭到轉(zhuǎn)印紙時,一次成功,?要重作,否則蛋白質(zhì)色帶可能會印上去,zui后產(chǎn)生重迭影像。

    5) 將轉(zhuǎn)印三明治置入已經(jīng)放有一半轉(zhuǎn)印緩沖液的轉(zhuǎn)印槽中,注意有轉(zhuǎn)印紙的那一面向正極 紅色,膠片那面向負(fù)極 黑色

    6) 當(dāng)三明治?放入轉(zhuǎn)印槽后,以轉(zhuǎn)印緩沖液蓋滿所有的三明治,小心動一動卡夾,除去附在卡夾內(nèi)外的氣泡,蓋上蓋子,放到一攪拌器上,打開攪拌器開始攪拌,同時接好電源,裝置完成后放置10 min。

    7) 400 mA 開始轉(zhuǎn)印,溫?會漸漸上升,轉(zhuǎn)印1.5 h 后中止轉(zhuǎn)印,取出轉(zhuǎn)印三明治,打開后依次取出轉(zhuǎn)印紙及膠片。

     上述轉(zhuǎn)印條件會使溫?上升至70~90℃,??卻系統(tǒng),可把溫?控制設(shè)在5℃;轉(zhuǎn)印槽內(nèi)應(yīng)該加以攪拌,以?使整個溫?分布均勻。

    8) 轉(zhuǎn)印后的膠片可以繼續(xù)進(jìn)?CBR 染色,看有無蛋白質(zhì)殘? ?電泳時加有藍(lán)色標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)marker (SeeBlue),則可在轉(zhuǎn)印紙上看到藍(lán)色的色帶,確定轉(zhuǎn)印成功,并可評估轉(zhuǎn)印效?。

    9) 轉(zhuǎn)印紙浸在約15 mL ?素洗液中浸洗過夜,期間換三次?素洗液,并且要溫和搖蕩的。

    10) ??做免疫染色,則轉(zhuǎn)印后??素洗液清洗,以清水沖過后改用amido black (l %溶于10%甲酸) 染色1 h,再以10%甲酸脫色,沖水后晾干即可,但其??較低。

滬公網(wǎng)安備 31011802001677號

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